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介紹

mRNA 疫苗是指將含有編碼抗原蛋白的 mRNA 導入人體，直接進行翻譯，形成相應的抗原蛋白，從而誘導機體產生特異性免疫應答，達到預防免疫的作用（圖1）。

mRNA 疫苗的優勢主要有：

1. 研發周期短、抗原選擇范圍廣，任何可成蛋白的抗原序列均可被選擇

2. mRNA 疫苗的半衰期與免疫原性可通過修飾和遞送系統來人工調節，由于不進入細胞核，無感染或插入突變的風險，安全性更高

3. 多種修飾后的 mRNA 更穩定，在細胞質中被高效攝取和表達；mRNA 疫苗具備自我佐劑特點，因此表現更強的免疫原性，有效性更高

4. 可通過體外轉錄技術快速、廉價地大規模生產 RNA 疫苗，在掌了病毒基因序列后即可在 40 天內完成疫苗樣品的生產制備

方法

該團隊首先關注了磷脂和緩沖液對 LNP 本身溫度敏感性的影響。由于 DSPC 的相變溫度(Tm)為 55℃，接近噴霧干燥器的出口溫度，而 DOPE 是一種不飽和磷脂，Tm 為 -16℃，可改善LNP的溫度敏感性，并有研究發現 DOPE 替代 DSPC 可以提高 mRNA 遞送效率[1]。LNP 中可電離脂質的 pKa=7，因此 pH 值的大幅變化可能會導致顆粒結構和穩定性的變化，該團隊測試了廣泛使用的 PBS 和 20 mM Tris 緩沖液的影響。該團隊將四種不同的 LNP 配方（DSPC PBS；DSPC Tris；DOPE PBS；DOPE Tris）在不同溫度范圍孵育以模擬LNP配方和噴霧干燥過程的溫度跨度。發現 DOPE Tris 組在高達 75℃ 的溫度下仍保持穩定，并且在 80℃ 時僅損失約 20% 的 RNA。

在噴霧干燥的溫度條件下更穩定不等于能更好地承受噴霧干燥過程，因此該團隊還驗證了 DOPE Tris LNP 能更好地承受噴霧干燥過程。DOPE Tris 組在噴霧干燥和復溶 306Oi10 和 MC3 LNP 時均增強了顆粒穩定性。 Tris 緩沖液在噴霧干燥方面優于PBS，雖然兩種緩沖液的 pH 值都會隨著溫度的升高而降低，但 Tris 的變化率比 PBS 快 10 倍，這意味著Tris緩沖液從 25°C 升至 37°C 時 pH 將減少 0.3 個單位，而 PBS 僅減少 0.025 個單位，pH 值的降低可能會確保RNA仍被封裝在LNP中。作者還發現優化的LNP配方(DOPE Tris)顯著提高了評估了 LNP 在肝細胞癌細胞系 HepG2 和肺支氣管細胞系 16HBE 中的攝取，與 4°C 下儲存的液體 LNP 制劑相比，通過噴霧干燥處理并在室溫下儲存的 LNP 具有更好的穩定性、更高的顆粒封裝效率以及更顯著的蛋白質表達（圖2）。

(A) 使用 DSPC 和 PBS 生產的 LNP 制劑對溫度升高敏感

(B) 當 DSPC 替換為 DOPE、PBS 替換為 Tris 時，噴霧干燥和重新分散后LNP顆粒的穩定性顯著提高。

(C) LNP 制劑在噴霧干燥(SD)后穩定性提高,導致  mRNA 對 HepG2 和 16HBE 細胞具有良好轉染效率。比例尺=100μm。**P<0.01、***P<0.001、****P< 0.0001、n.s=不顯著。

該團隊發現，當噴霧干燥 LNP 制劑時，在干燥塔內可觀察到均勻的薄膜，在旋風分離器中可觀察到薄膜沉積物，這是因為在無賦形劑的情況下，噴霧干燥 LNP 制劑中每種成分的固化機制將根據其擴散速率和溶解度而有所不同，引起各組分分離。因此該團隊優化了 LNP、海藻糖、三亮氨酸的比例[2]。發現 LNP 與三亮氨酸的比例為 1:4 至 1:5 時，可以減少旋風分離器中的粉末損失，并進一步提高復溶后的 mRNA 封裝效率，將 LNP 負載從 1.5% 增加到 5%。噴霧干燥后，通過 SEM 分析粉末粒徑和表面結構，通過 CryoTEM 分析復溶的顆粒。發現噴霧干燥后復溶的 LNP 樣品為尺寸范圍變化更大的致密小囊泡（圖3）。

(A) 粉末配方中三亮氨酸(LLL):LNP 比例的優化可將旋風分離器中的損失降至最低，并隨著重構后 RNA 封裝效率 (%EE) 的增加而實現產量最大化。

(B) 噴霧干燥產生 LNP 的掃描電鏡照片。當三亮氨酸(LLL)的濃度從 3% 增加到 15% 時，顆粒的形態逐漸從光滑的表面變成高度波紋狀的表面。

(C) 新制 LNP 和噴霧干燥 LNP 代表性冷凍透射電子顯微鏡圖片。與新鮮 LNP 相比，噴霧干燥 LNP 復溶后被包裹在致密的襯里。比例尺 =200nm。 

接下來，該團隊驗證了 mRNA LNP 粉末制劑在體內的功能性遞送。使用 Penn-Century Dry Powder Insufflator?-4 裝置對動物進行給藥，該裝置可以將粉末直接輸送到大鼠的肺部。肺組織切片上的免疫組化(IHC)顯示出強烈的 eGFP 陽性細胞染色。這些細胞根據其定位、形態和免疫熒光標記被鑒定為細支氣管上皮細胞、II 型肺細胞和/或巨噬細胞。盡管僅識別出少數 eGFP 陽性細胞，但這些陽性細胞的染色強烈、且無背景噪點，表明 eGFP mRNA LNP 在噴霧干燥后吸入給藥，可在肺部產生清晰的 eGFP 表達。

(A) 大鼠肺示意圖

(B) 研究設計的示意圖。

單次給藥后 24 小時或連續3天每日給藥后 24 小時處死大鼠。給藥方式包括氣管內(IT)滴注含有 eGFP mRNA LNP 的噴霧干燥制劑或安慰劑。

(C) 在右肺葉的肺勻漿中測量的 eGFP 蛋白水平

(D) 顯示 eGFP 陽性細胞（紫色）的圖像

(E) IT 滴注單次(I和III）和 3 天重復(II和IV)給藥后 24 小時在大鼠左肺葉中檢測到的 eGFP(棕色)。eGFP 陽性細胞（紫色）形態學上鑒定為細支氣管上皮細胞 (D I) 和 II 型肺細胞和巨噬細胞 (D II)。在細支氣管上皮細胞(E I)和 II 型肺細胞和巨噬細胞(E II)中鑒定出 eGFP mRNA (棕色)。

(F) eGFP 的免疫熒光標記與 II 型肺細胞或巨噬細胞標記物結合，證實兩種細胞類型都表達 eGFP。

(G) 左肺葉的組織病理學分析結果。

左上：來自對照大鼠的肺組織，顯示沒有病變。

左下：治療 3 天的大鼠肺組織，顯示肺泡實質中的實變區域，代表炎癥病變（箭頭）。

中圖：混合炎癥細胞浸潤區域的較高放大倍數，以較小的氣道和描繪肺泡管為中心。

右圖：代表次級細支氣管上皮變化的圖像。

結論

總的來說，該研究團隊進行了一項概念驗證研究，并成功通過配方優化，設計出了用于吸入的 mRNA LNP 噴霧干燥制劑。該制劑在經過噴霧干燥和復溶后仍保持功能，并可在體外和體內有效遞送 mRNA，能夠以臨床相關劑量水平實現 LNP 的肺部給藥，在吸入式 mRNA 疫苗領域開辟了新道路，具有巨大前景。

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參考文獻

1. Chaudhary, N., Weissman, D. & Whitehead, K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov 20, 817–838 (2021).

2. Friis K P, Gracin S, Oag S, et al. Spray dried lipid nanoparticle formulations enable intratracheal delivery of mRNA[J]. Journal of Controlled Release, 2023, 363: 389-401.

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